Desinfección del SARS

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8229 (2023) Citar este artículo

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La radiación ultravioleta es una herramienta eficaz para la desinfección de virus en general y de coronavirus en particular. Este estudio explora la cinética de desinfección de las variantes de SARS-CoV-2 de tipo salvaje (similar a la cepa de Wuhan) y tres variantes (Alpha, Delta y Omicron) mediante LED UV de 267 nm. Todas las variantes mostraron una reducción promedio de más de 5 logs en el número de copias a 5 mJ/cm2, pero la inconsistencia fue evidente, especialmente para la variante Alpha. El aumento de la dosis a 7 mJ/cm2 no aumentó la inactivación promedio, pero resultó en una disminución drástica en la inconsistencia de la inactivación, lo que convirtió a esta dosis en la mínima recomendada. El análisis de secuencia sugiere que la diferencia entre las variantes probablemente se deba a pequeñas diferencias en la frecuencia de motivos específicos de secuencia de nucleótidos ultrasensibles a UV, aunque esta hipótesis requiere más pruebas experimentales. En resumen, el uso de UV-LED con su simple necesidad de electricidad (puede funcionar con una batería o un panel fotovoltaico) y la flexibilidad geométrica podría ofrecer muchas ventajas en la prevención de la propagación del SARS-CoV-2, pero se debe tener cuidado con la dosis mínima de UV. consideró.

La eficiencia de la irradiación ultravioleta (UV) depende de múltiples factores, como la dosis UV, la irradiancia, la fuente de irradiación, el tipo de cepa y microorganismo, la matriz y la longitud de onda UV. Los diodos emisores de luz ultravioleta (LED ultravioleta) emiten luz ultravioleta en longitudes de onda específicas con anchos de banda completos relativamente estrechos a la mitad del máximo (FWHM). Por ejemplo, las longitudes de onda de UV LED o mercurio policromático en el rango germicida mostraron una menor efectividad en longitudes de onda UV más altas1,2, mientras que se encontraron discrepancias en la ley de reciprocidad de dosis-tiempo para LED UV de diferentes longitudes de onda y mecanismos de daño UV (Ref.3; ver también la Tabla 2).

La radiación UV es eficaz en la inactivación de virus en diversos entornos, como soluciones acuosas1,4, en superficies5,6 y en aire/bioaerosoles7,8. La radiación ultravioleta también resultó eficaz en la inactivación de los coronavirus humanos (p. ej., hOC431) y el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV2)9,10. Sin embargo, los brotes de SARS-CoV-2 se caracterizan por la rápida aparición de variantes11,12, lo que complica las comparaciones entre estudios realizados sobre diferentes variantes de SARS-CoV-2. Nuestro estudio anterior examinó el impacto de las longitudes de onda de los LED UV en una cepa de coronavirus humano (hCV-431). Aquí examinamos la sensibilidad de cuatro variantes diferentes del SARS-CoV-2 (tipo salvaje, Alpha, Delta y Omicron) a la longitud de onda germicida UV-LED con una emisión máxima de 267 nm.

Los espectros UV-LED exhibieron una emisión máxima a 267 nm con un ancho de banda FWHM estrecho de 12 nm (Fig. 1).

Espectros de emisión del LED UV de 267 nm utilizado en este estudio.

A la dosis cero (sin exposición a UV), se encontró una variación entre los números iniciales de copias de virus de las diferentes variantes, pero el análisis ANOVA de una vía no reveló diferencias estadísticamente significativas (F3,60 = 0,2941, p = 0,83). El tiempo de irradiación y la curva de respuesta a la dosis (fluencia) de diferentes variantes de SARS-CoV-2 a LED UV de 267 nm se presentan en la Fig. 2. La primera inactivación estadísticamente significativa para las variantes wt, Delta y Omicron requirió exposición a 2 mJ/cm2, mientras que la variante Alpha requirió 5 mJ/cm2 (Fig. 2b), con dosis más altas que resultaron en una meseta hasta la dosis máxima (10 mJ/cm2). Curiosamente, la variabilidad en la eficiencia de inactivación dependía tanto de la dosis de UV como de la variante, como lo demuestra el tamaño de las barras de error (Fig. 2) y el gran coeficiente de variación, especialmente para la variante Alpha (Tabla 1). Esta variabilidad en las dosis más bajas debería desempeñar un papel al diseñar un sistema de desinfección para mitigar los coronavirus y se recomienda una dosis de UV-LED de 7 mJ/cm2. Además, la irradiancia incidente del LED fue baja en este caso; sin embargo, los LED más potentes (que dan lugar a un mayor flujo radiante en un tiempo de exposición determinado) podrían mitigar el riesgo de esta variabilidad y deben examinarse.

Tiempo de irradiación UV267nm y curvas dosis-respuesta de las diferentes variantes del SARS-CoV-2 (irradiación incidente ponderada 0,152 mW/cm2). Los puntos de datos son promedios (N = 11–16 para 0 a 5 mJ/cm2 y N = 4 para 7 mJ/cm2 y más). Las barras de error indican 1 SD.

Para descifrar el mecanismo que subyace a la diferente eficiencia de inactivación, examinamos más a fondo las secuencias de la variante, centrándonos en las secuencias de extensión YTTC y YCTY ('Y' es C o T), consenso para el aducto de 6-4PP inducido por UV de mayor intensidad y el daño de CPD, respectivamente17 . La Tabla 2 informa el número de apariciones de estas secuencias en las secuencias de las diferentes variantes (consulte la alineación de secuencias en la Fig. S1 complementaria), lo que demuestra que la variante Alfa tiene la apariencia más baja de tales secuencias, de acuerdo con su mayor tolerancia y variación en respuesta a UV a dosis intermedias (es decir, 2 mJ/cm2). Esta hipótesis, de ser correcta, sugeriría que pequeños cambios en la secuencia del genoma del virus podrían dar lugar a cambios drásticos en su resistencia a los rayos UV, y debería tenerse en cuenta al buscar el uso de la radiación UV como forma de combatir los virus patógenos.

Los datos presentados en la Fig. 2b encajan muy bien con los resultados publicados anteriormente, tanto en lo que sugiere que UVC puede ser eficaz contra los virus SARS-CoV-2 como en las dosis necesarias para una inactivación eficiente (Tabla 3). Cabe señalar que los datos publicados anteriormente sobre la inactivación del virus SARS-CoV-2 en suspensión sugirieron que se necesitaban dosis más altas para una reducción de 3 log (comparar la Tabla 3, líneas 1, 4, 6, 7 y 8), probablemente debido a la adición de proteína a la suspensión8, sirviendo como absorbente UV. Cuando se compararon directamente la suspensión y los aerosoles8, se requirieron dosis mucho más bajas para una activación similar del virus en este último (ver línea 7 en la Tabla 3), probablemente debido al tamaño de gota mucho más pequeño en el aerosol (en Ref.8 más del 80% de las gotas eran menores de 1 µm mientras que las gotas de la suspensión probablemente tenían ~ 1 mm, dado que usaron un volumen similar al que se presenta aquí).

En resumen, tanto nuestros resultados como los anteriores sugieren que la radiación UVC se puede usar para combatir el coronavirus humano mientras se mitigan los efectos ambientales del uso de desinfectantes y se permite la reutilización de máscaras de respiración9,18, lo que reduce los desechos plásticos que se originan de tales19. Además, el uso de UV como desinfectante puede reducir el uso de desinfectantes químicos ambientalmente problemáticos20 y lámparas UV que contienen mercurio (en línea con la convención de Minamata para reducir la contaminación global por mercurio). El formato pequeño de los LED UV y el circuito eléctrico simple necesario para los LED UVC también podrían respaldar su incorporación en los sistemas de ventilación de aire21, aunque dicha aplicación aún está limitada por la eficiencia de emisión de los LED UV.

En este estudio se utilizaron cuatro variantes del SARS-CoV-2: wt (cepa similar a wt, B.1.1.50, que circuló en Israel en 2020); Alpha (B.1.1.7 501Y.V1), que contiene múltiples mutaciones de espiga, demostró tener una tasa de transmisión un 70 % más alta que la cepa wt13; Delta (B.1.617.2), informó que era más infeccioso y causaba una enfermedad más grave en comparación con la variante Alfa13; y Omicron (B.1.1.529), que contiene más de treinta mutaciones de aminoácidos en la proteína espiga y demuestra una tasa de mutación que supera la de otras variantes entre 5 y 11 veces, así como una mayor transmisibilidad y evasión inmunitaria14. Todas las variantes del virus se aislaron en el laboratorio de Mandelbaum a partir de muestras de hisopos respiratorios sobrantes (muestras completamente anonimizadas) utilizadas para el diagnóstico de rutina y se encontraron positivas para SARS-CoV-2. Todos los protocolos se realizaron con la aprobación del Comité de Helsinki del Centro Médico Sheba (número 7875-20-SMC) y, en estas circunstancias, los hospitales no requieren consentimiento informado. Los virus se identificaron mediante secuenciación (secuencias depositadas en la base de datos del banco de genes del NCBI con los números de acceso OQ948263 a OQ948266, respectivamente). respectivamente) . La propagación de los virus fue como se describió previamente15.

La fuente UV era un dispositivo UV-LED hecho a medida construido en colaboración con AquiSense, con una longitud de onda de emisión máxima de 267 nm (Fig. 1)1,16. La irradiancia incidente ponderada fue de 0,152 mW/cm2 en el centro del área de exposición (medida con un espectrorradiómetro Ocean Optics USB4000 calibrado, equipado con un corrector de coseno e integrado para 250–290 nm). La dosis de UV (mJ/cm2) se determinó multiplicando la irradiación medida (mW/cm2) por el tiempo de irradiación (segundos).

La irradiación de virus se realizó como se describió previamente1. Brevemente, la suspensión de virus se diluyó en medio esencial mínimo de Eagle sin rojo fenol (UVT > 95 %) a una concentración de 10 × 100TCID50 (es decir, 1000 veces la dilución de un virus requerida para infectar el 50 % de las células en el cultivo celular22, aquí dentro de los 5 días de la infección). Se colocaron cincuenta µl de esta suspensión de virus en cada pocillo de una placa negra de 24 pocillos (dando una capa de ~ 1 mm de altura en el punto más alto). Todos los pozos fueron cubiertos con cinta aislante negra. Cada vez antes de la irradiación, se retiró la cinta de una columna de 4 pocillos o una fila de 6 pocillos durante el tiempo designado1,16, lo que resultó en 4 o 6 réplicas por placa, según corresponda. En cada placa ensayada, se dejó cubierta una columna/fila de pocillos durante toda la irradiación para que sirviera como control sin UV y como referencia de irradiancia 0. El proceso se repitió tres veces para los tiempos de irradiación más cortos (1, 2 y 5 mJ/cm2) debido a la importante variabilidad de los resultados. El control de irradiación cero se mantuvo cubierto con la cinta durante todo el proceso de irradiación para permitir otros efectos.

La cuantificación del virus se realizó después de la proliferación, cuantificando así solo los virus capaces de infectar. Con este fin, después de la irradiación, se añadieron a cada pocillo (incluidos los pocillos "sin UV") 450 µl de medio esencial mínimo de Eagle suplementado con suero bovino fetal al 2% (v/v) (MEM-EAGLE); el contenido se mezcló mediante pipeteo y se transfirieron 50 µl a un pocillo de una placa de 96 pocillos (Applied Biosystems, EE. concentración de virus de 100TCID50 por pocillo (para virus preirradiados). Las placas se incubaron durante 1 h a 33 °C, los virus no adheridos se lavaron con medios mediante pipeteo y se agregaron 200 μL de medio MEM-EAGLE que contenía FCS al 2 %. Luego, las células se incubaron en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 33 °C durante cinco días adicionales. El ARN total se extrajo de las células usando un instrumento MagNA Pure 96 (Roche Life Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El número de copias de virus en las células se determinó mediante transcriptasa inversa - qPCR (realizado en un termociclador CFX-96, Bio-Rad, EE. UU.) y se comparó con una curva de calibración construida a partir de soluciones de virus de títulos conocidos. Los oligonucleótidos utilizados fueron E_Sarbeco_F (ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT) y E_Sarbeco_R (ATATTGCAGCAGTACGCACACA) y la sonda E_Sarbeco_P1(FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ), con las condiciones descritas en Ref.23.

La inactivación logarítmica se calculó para cada combinación variante-preparado por separado como logaritmo (N0/N), siendo N y N0 concentraciones virales con y sin irradiación respectivamente, para corregir la variabilidad en los números iniciales de virus (tanto para diferentes preparaciones de la misma variante como entre variantes en la misma fecha de preparación). Con este fin, el número de virus en cada pocillo (Ec. 1, variante Ndose) se dividió por el número medio de virus de los pocillos noUV correspondientes a las variantes específicas medias en la misma placa (Eq. 1, variante N0).

Todos los análisis se realizaron con estadísticos SPSS para Windows v.24 (IBM, publicado en 2016) con sumas de cuadrados tipo III.

La cuantificación de los motivos sensibles a los rayos UV se realizó en R (versión 4.1.3; 2022-03-10) utilizando un código personalizado (consulte la información complementaria). La comparación de secuencias se realizó con el algoritmo MAFFT (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/) y la alineación con Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/).

Esta investigación fue parcialmente financiada por la subvención interna de Oranim Academic College y por el Centro de Lucha contra las Pandemias de la Universidad de Tel Aviv (TCCP).

Las secuencias de las variantes utilizadas en este estudio se depositaron en (secuencias depositadas en la base de datos del banco de genes del NCBI con los números de acceso OQ948263 (wt), OQ948264 (Alpha), OQ948265 (Delta), OQ948266 (Omicron). Las secuencias también se pueden encontrar en https https://gisaid.org/ con los números de acceso EPI_ISL_745046, EPI_ISL_737204, EPI_ISL_2183060 y EPI_ISL_7869197, respectivamente) https://gisaid.org/ con los números de acceso EPI_ISL_745046 (wt), EPI_ISL_737204 (Alpha), EPI_ISL_218 3060 (Delta) y EPI_ISL_7869197 (Omicron) .

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Descargar referencias

La investigación fue parcialmente financiada por el Centro de la Universidad de Tel Aviv para Combatir las Pandemias https://en-pandemics.tau.ac.il/ (HM) y por la subvención interna de Oranim College (YG).

Estos autores contribuyeron por igual: Michal Mandelboim y Yoram Gerchman.

Laboratorio Central de Virología, Ministerio de Salud, Centro Médico Chaim Sheba, Tel-Hashomer, Ramat-Gan, Israel

Nofar Atari, Neta Zuckerman y Michal Mandelboim

Escuela de Ingeniería Mecánica, Facultad de Ingeniería, Universidad de Tel Aviv, 69978, Tel Aviv, Israel

Hadas Mamane

Departamento de Biología y Medio Ambiente, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Haifa-Oranim, Kiryat Tiv'on, Israel

Alon Silberbush

Departamento de Epidemiología y Medicina Preventiva, Escuela de Salud Pública, Universidad de Tel-Aviv, Tel Aviv, Israel

michal mandelboim

El Instituto de Evolución, Universidad de Haifa, Haifa, Israel

Yoram German

Oranim College, 3600600, Tivon, Israel

Yoram German

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NA Experimentos realizados y datos recopilados, revisión del manuscrito. Financiamiento garantizado por HM, revisión del manuscrito. AS Realizó análisis estadístico, revisión del manuscrito. NZ Realizó análisis de secuencias bioinformáticas, revisión del manuscrito. MM Concebido y diseñado el análisis, experimentos supervisados, revisión del manuscrito. YG concibió y diseñó el análisis, aseguró la financiación, escribió el primer borrador y la revisión del manuscrito.

Correspondencia a Yoram Gerchman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Atari, N., Mamane, H., Silberbush, A. et al. Desinfección de SARS-CoV-2 por UV-LED 267 nm: comparando diferentes variantes. Informe científico 13, 8229 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35247-9

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Recibido: 23 de septiembre de 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35247-9

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